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慢病毒包裝試劑盒

Lentiviral Packaging Kit

產(chǎn)品貨號：JY03021      規(guī)格：10T (10 cm dish)      銷售價格：￥1400

產(chǎn)品貨號：JY03022      規(guī)格：20T (10 cm dish)      銷售價格：￥2700

產(chǎn)品貨號：JY03023      規(guī)格：40T (10 cm dish)      銷售價格：￥5300

慢病毒包裝試劑盒 說明書.pdf

產(chǎn)品簡介

江苑生物的慢病毒包裝試劑盒（Lentiviral Packaging Kit）由優(yōu)化的慢病毒包裝輔助質(zhì)粒混合物（Packaging Mix）、表達綠色熒光蛋白的對照質(zhì)粒（eGFP Control）和高效的轉(zhuǎn)染試劑（Transfection Reagent）組成，可以兼容第二代和第三代的慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)。

PackagingMix能夠表達病毒包裝需要的各種必需成分如：gag基因，編碼病毒的核心蛋白如基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白和核衣殼蛋白；pol基因，編碼病毒復(fù)制所需的酶如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶和蛋白酶；rev基因，編碼調(diào)節(jié)gag和pol基因表達的調(diào)節(jié)因子；還含有單純皰疹病毒來源的VSV-G基因，提供病毒包裝所需要的包膜蛋白。江苑生物的慢病毒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生的慢病毒為“自殺”性病毒，即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞，也不會利用宿主細胞產(chǎn)生新的病毒顆粒。慢病毒中的毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。

本試劑盒具有慢病毒包裝時間周期短（一周之內(nèi)即可獲得純化好的高滴度慢病毒）和病毒滴度高的優(yōu)勢，可應(yīng)用于針對不同基因和藥物靶標的細胞學(xué)實驗和整體動物實驗。非常適合于病毒包裝初試者。為了加速科研進程，江苑生物還提供細胞基因過表達、shRNA/siRNA介導(dǎo)的基因沉默、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除等服務(wù)。

產(chǎn)品組分

保存條件

干冰運輸。Transfection Reagent收貨時為冰凍狀態(tài)，使用時再融化，并轉(zhuǎn)為4 oC長期保存，1年有效（6個月以上不用，可-20oC保存延長使用期限），切忌反復(fù)凍融，影響轉(zhuǎn)染效果。其余組分均于-20℃保存, 避免反復(fù)凍融，1年有效。

注：瓶身標記MFG為生產(chǎn)日期，因為生化與分子試劑貯存得當(dāng)，可用時間長于有效期，故標出生產(chǎn)日期，方便提示試劑實際已貯存時間。

注意事項

1．廢棄的含病毒的培養(yǎng)基中加入84消毒液（1:20左右），浸泡1天后丟棄。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養(yǎng)板等其他物品可用84消毒液稀釋液處理，也可以用煮沸處理半小時或常規(guī)滅菌（121℃，20 min）。

2．本產(chǎn)品僅用于科學(xué)研究。

3．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

還需準備的其他實驗材料

1．被包裝的慢病毒載體質(zhì)粒：在慢病毒包裝前，需要先獲得含有目的序列的慢病毒載體，以無內(nèi)毒素高純度的試劑盒提取表達目的基因的慢病毒載體質(zhì)粒，并將質(zhì)粒DNA溶于無菌的TE或ddH₂O中，測定其濃度及純度，保證質(zhì)粒DNA的A260/A280在1.8-2.0之間。

2．慢病毒包裝用293T細胞株：良好的細胞狀態(tài)對病毒的包裝至關(guān)重要，避免細胞培養(yǎng)基有細菌、真菌或支原體的污染，盡量使用傳代次數(shù)較少的細胞，如果細胞是剛復(fù)蘇的話，更好傳兩代之后再包裝。

3．細胞培養(yǎng)基，血清和雙抗等

4．其他常用實驗耗材（如10 cm培養(yǎng)皿，離心管等）

使用說明

以10 cm培養(yǎng)皿為例：

1．293T細胞分盤：轉(zhuǎn)染前，將293T細胞以合適的比例傳代到10 cm培養(yǎng)皿中，當(dāng)細胞長到70%-90%時準備轉(zhuǎn)染。

注：細胞要充分消化，成團細胞影響轉(zhuǎn)染效率。

2．轉(zhuǎn)染前換液：轉(zhuǎn)染前將需要轉(zhuǎn)染的細胞換成新鮮的完全培養(yǎng)基（含有血清和抗生素），10 mL/10 cm皿。注：293T細胞貼壁性不是很好，換液時應(yīng)小心滴加盡量避免沖起細胞。抗生素和血清不會影響轉(zhuǎn)染效率，也不會在細胞轉(zhuǎn)染后導(dǎo)致細胞毒性。

3．轉(zhuǎn)染：取無菌的離心管，加入750 μL DMEM（不含血清和抗生素），10 μg表達目的序列的慢病毒載體質(zhì)粒（自行提供），和13.5 μL Packaging Mix，用槍輕輕吹打混勻；再加入32 μL Transfection Reagent，用槍輕輕吹打混勻，靜置5 min，請?zhí)貏e注意不可Vortex或離心。將混合液均勻滴加到提前換液的細胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，后續(xù)無需在數(shù)小時后更換培養(yǎng)液。

注：上述混合液室溫存放6 h內(nèi)穩(wěn)定。

某些細胞對轉(zhuǎn)染試劑比較敏感，可以在轉(zhuǎn)染后6-8小時更換細胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染效率無顯著影響。

4．病毒收集：轉(zhuǎn)染36 h左右后，吸取上清至新的離心管中，4℃保存。另外添加10 mL新鮮的完全培養(yǎng)基到細胞中，注意不要沖起細胞。再次大約36 h后，收取上清至同一個離心管中。

5．將兩次收集的病毒上清用0.45 μm濾器過濾后轉(zhuǎn)移到新的離心管中（若沒有0.45 μm濾器，直接將病毒上清3000 rpm，4 ℃離心5 min，棄沉淀亦可）。此時上清液中的病毒顆粒可以直接檢測滴度或者感染目的細胞，如果對病毒的滴度及純度有較高要求，可對上清液進行濃縮與純化。

注：如果使用濾器過濾，只能使用低蛋白結(jié)合力的纖維素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜，不能用硝酸纖維素膜（NC）。若上清較多，可以1500 rpm離心5 min，將細胞及碎片離心到管底，再進行過濾，防止堵塞濾器。過濾時，將注射器與濾器卡緊，輕柔推動活塞，防止用力過度造成濾器崩離注射器，使得病毒液四濺。

6．（可選）慢病毒濃縮的與純化：可以使用江苑生物的慢病毒濃縮試劑盒（JY03011）進行慢病毒濃縮與純化，效率更高。同時，也可以自行配制PEG-8000慢病毒濃縮液濃縮慢病毒。

注：慢病毒滴度測定方法參考http://www.fkzjian.com.cn/news/xingyedongtai/179.html（江苑生物官網(wǎng)→新聞中心）

7．病毒分裝與保存：將病毒上清或濃縮后的病毒分裝，保存于-80℃。

注：病毒液一定要分裝，切忌反復(fù)凍融，凍融一次病毒滴度將降低20-60%。

圖1 江苑生物與**公司慢病毒包裝試劑盒包裝效率比較

包裝效率低可能存在的問題

1．優(yōu)化質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑比例，對于難轉(zhuǎn)染的細胞，可適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染試劑的用量。

2．應(yīng)使用高純度、無內(nèi)毒素、無污染物的質(zhì)粒進行包裝，DNA純度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-2.0范圍內(nèi)，偏低則有可能有蛋白污染，偏高則有可能有RNA污染。

3．包裝細胞（例如293T）狀態(tài)對病毒的包裝很重要，盡量使用傳代次數(shù)較少的細胞。狀態(tài)不好的293T可能導(dǎo)致包裝效率降低60%以上。輕柔換液就能導(dǎo)致半數(shù)細胞漂起，這樣的293T細胞再高效的包裝試劑盒也無濟于事。請從正規(guī)細胞庫購買細胞，借來或者不正規(guī)公司獲得的細胞可能會因為傳代次數(shù)過多影響包裝效率。復(fù)蘇的包裝細胞更好傳兩代之后再包裝。避免細胞培養(yǎng)基有細菌、真菌或支原體的污染。

4．表達目的序列的載體質(zhì)粒過大，會降低包裝效率。載體質(zhì)粒容納外源基因長度的能力是有限的，盡管理論上，在LTR之間可以插入的基因長度約為8.5 kb，但超過3 kb就會導(dǎo)致包裝效率降低。而整個載體質(zhì)粒過大，也會導(dǎo)致包裝效率降低，進而影響最后的病毒滴度。若不能控制插入片段的大小，需盡量選擇較小的載體骨架。

5．CRISPR-Cas9質(zhì)粒中，Cas9基因長度就達4 kb左右，整個載體質(zhì)粒15 kb左右，故其慢病毒包裝效率和感染能力比一般病毒低，包裝時產(chǎn)生的空殼病毒（即有病毒外殼，但沒有組裝進目的基因的病毒）比較多。感染細胞時，空殼病毒會競爭細胞表面受體，造成正確感染率下降，因此密度梯度離心、PEG純化法和超濾法等濃縮病毒再感染目的細胞可提高病毒感染效果。